LNP作为新冠疫苗的载体，其表现出了优秀的递送核酸类药物的能力。与传统腺病毒载体（AAV）相比又具有较高的生物安全性和更低的免疫原性。
来自京都大学iPS细胞研究所(CiRA)的Akitsu Hotta教授于2021年在Nature Communication上发表了题为《Low immunogenicity of LNP allows repeated administrations of CRISPR-Cas9 mRNA into skeletal muscle in mice》的文章。他们为治疗杜氏肌营养不良（DMD），采用了LNP递送CRISPR-Cas9系统，编辑了抗肌萎缩蛋白基因的方式进行了治疗。相较于传统的AAV递送反义寡核苷酸（ASO）的方法，具有更低的免疫原性，可以实现重复给药从而达到持续治疗的目的。
1、LNP与AAV递送Luciferase的能力比较
结论：LNP相较于AAV，虽然持续时间短，但起效更快，荧光强度的峰值更高。
在作者的前期工作中，合成并筛选了一种更适用于其实验方案的可电离脂质TCL053，并用其合成LNP（Fig. 1A、B）。作者用LNP包裹Luc-mRNA；用AAV包装Luc-cDNA，同时将两者注射到小鼠的腓肠肌中进行比较。LNP-Luc mRNA在注射2小时即产生可观测荧光，而AAV-Luc cDNA则于7天后才观察到荧光，且前者峰值高于后者，并呈剂量依赖效应（Fig. 1C、D、E）。
2、sgRNA对抗肌萎缩蛋白基因45号外显子跳跃的验证
结论：hEx45 sgRNA #1与hEx45 sgRNA #23联用可以有效实现抗肌萎缩蛋白基因45号外显子的跳跃
抗肌萎缩蛋白44号外显子的缺失会使得其无法正常表达，是DMD患者的病因之一。该情况下，若跳过45号外显子就可以正常表达（Fig. 2B）。作者发现hEx45 sgRNA #1与hEx45 sgRNA #23可以分别剪切抗肌萎缩蛋白基因45号外显子上下游的两个位点（Fig. 2A）。
为了验证两个sgRNA的剪切效率，作者将不同的sgRNA包裹于LNP内，转染病患来源诱导的成肌细胞，使用RT-PCR与Western blot进行检测（Fig. 2C）。结果显示，hEx45 sgRNA #1与hEx45 sgRNA #23的联用可以使45号外显子的跳跃率达到43.6%（Fig. 2D）并使15%的抗肌萎缩蛋白恢复正常表达（Fig. 2E），均优于单独转染。
3.人源抗肌萎缩蛋白异常的小鼠模型的构建
结论：成功构建了hEx45KI-mdx44的小鼠模型，其抗肌萎缩蛋白缺失44号外显子，并具有人源45号外显子，无法正常表达。
作者将小鼠X染色体上的小鼠抗肌萎缩蛋白45号外显子替换为人源45号外显子，敲除44号外显子模拟病患基因型（Fig. 3A）。构建完成的小鼠模型命名为hEx45KI-mdx44。经RT-PCR（Fig. 3B）和测序双重验证（Fig. 3C）。Western blot结果说明，在小鼠中45号外显子的替换不会影响抗肌萎缩蛋白的正常表达，而44号外显子的敲除则使得抗肌萎缩蛋白不表达（Fig. 3D）。经免疫荧光检测，在hEx45KI-mdx44小鼠模型的胫骨前肌中，抗肌萎缩蛋白明显少于hEx45KI小鼠（Fig. 3E）。类似的，hEx45KI-mdx44小鼠模型的腓肠肌重量与肌酸激酶水平都高于正常小鼠与hEx45KI小鼠，代表其肌肉存在病理性缺陷（Fig. 3F、G）。至此hEx45KI-mdx44小鼠模型成功构建，可作为研究DMD治疗方法的理想模型。
4、在hEx45KI-mdx44小鼠模型中LNP递送与ASO的优劣比对
结论：hEx45 sgRNA #1与hEx45 sgRNA #23联用，可以长效稳定地使得模式小鼠表达抗肌萎缩蛋白，效果优于静脉注射ASO
hEx45KI-mdx44小鼠模型中，sgRNA #1与hEx45 sgRNA #23联用相比单独使用，可达到更高的外显子跳跃率（Fig. 4A）。
反义寡核苷酸（ASO）是治疗该类疾病的另一种方式。在给药前期，LNP的外显子跳跃效率虽然略低于静脉注射的ASO，但LNP的治疗效果可以持续更久，达到一年。长期治疗效果、治疗时长皆优于ASO（Fig. 4B）。通过胫骨前肌的Western blot验证，也可以说明LNP相较于ASO具有更稳定更长效的治疗效果（Fig. 4C、D）。
5、在hEx45KI-mdx44小鼠模型中检验LNP的治疗效果
结论：LNP较AAV，具有更低的免疫原性，可以实现有效的重复给药
作者在表达Luciferase的小鼠基因中插入人抗肌萎缩蛋白45号外显子的序列（Fig. 5A）以检测敲除效率。以LNP对比传统的AAV载体，同样包裹CRISPR-Cas9系统与两种hEx45 sgRNA，注射入小鼠右腿；经28天后再注射入左腿，再经28天后检测荧光（Fig. 5B）。接受AAV载体的小鼠仅右腿检测到荧光，而LNP注射的小鼠左右腿都具有荧光（Fig. 5C）。AAV在注射后可能因引起免疫反应无法实现有效的二次给药，而LNP具有低免疫原性，可重复给药。
在此基础上，以一个月为间隔重复三次注射LNP，可使抗萎缩蛋白的恢复率从一次的1.1%上升到了4%（Fig. 5D）。免疫荧光、肌纤维与中心核等标志的检测也证明多次注射LNP可以获得较好的治疗效果（Fig. 5E、F、G）。
6、LNP-CRISPR注射剂量及注射方式的优化
结论：肢体灌注相较于静脉给药可更广泛地恢复hEx45KI-mdx44小鼠的下肢肌肉抗萎缩蛋白含量
为了验证LNP能否治疗小鼠整个下肢肌群，作者进行了不同注射方式的测试（Fig. 6A），同时比较了不同体积相同RNA与不同RNA相同体积的LNP与静脉注射的差异（Fig. 6B、C），作者将小鼠的股四头肌用止血带捆住后，从背侧大隐静脉注射LNP。肢体灌注中，除了被捆绑的股四头肌外，其余肌肉的抗肌萎缩蛋白基因都有很好的外显子跳跃率，而肌肉注射仅胫骨前肌可以观察到有效的外显子跳跃。Western blot检测腓肠肌与胫骨前肌也可以发现，相应的注射治疗均有剂量依赖效应（Fig. 6D）。
以上是对这篇文献结果的汇总。在新冠疫苗中发挥了重要作用后，LNP作为一种高效的药物递送载体，在其他疾病治疗过程中的应用是目前热门的研究方向。这篇文章中，不仅给出了以LNP-CRISPR治疗DMD的可能性，还说明了LNP在作为递送药物的载体时，拥有更低的免疫原性、起效快等优势，证明了LNP是递送药物的优质载体。
公安备案号31011002005499