MERFISH：从单分子成像到空间转录组学的高通量探索

近年来，空间转录组技术（Spatial Transcriptomics, ST）迅速发展，为探索细胞功能、调控机制及微环境互作提供了前所未有的空间视角。它被 Nature Methods 评为2020年度技术（Method of the Year 2020），并被誉为“将彻底改变细胞生物学、病理学及组织学的研究方式”。

空间转录组分类

空间转录组结合高通量转录组测序与组织结构空间信息，弥补了传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）在空间定位上的缺陷。ST技术主要分为两类：

• 测序型 ST（sST）：通过空间条形码阵列捕获RNA，实现空间分辨测序（图1b）；
• 成像型 ST（iST）：基于荧光探针与循环成像，在单分子分辨率下实现靶基因的原位检测（图1c）。

其中，MERFISH（Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization）是具有代表性的突破性成像型ST技术。它融合smFISH与条形码编码原理，可在单细胞乃至亚细胞分辨率下，同时检测上千种RNA分子，精准定位其空间分布，极大推动了细胞微环境与组织结构的精细研究。

图1. 空间转录组主要分类^[1]

MERFISH 技术原理

MERFISH通过组合编码和多轮荧光成像，实现了高通量空间转录组测量。其工作流程主要包括以下步骤^[2]：

MERFISH 核心步骤：利用多轮荧光成像技术逐位读取RNA分子的条形码信息：第1轮使用识别第1位的荧光探针，RNA编码中第1位为“1”的分子发光；第2轮检测第2位为“1”的分子发光；依此类推，逐轮读取所有位点。每轮成像后，进行漂洗操作清除上一轮的荧光信号，确保每一轮成像结果独立准确。所有轮次成像结束后，计算机算法将每个RNA分子在不同轮次中的“亮/暗”模式还原为完整的二进制条形码，并与预设编码表进行比对，最终精确识别RNA的种类与空间分布。

图2. MERFISH - 多轮荧光成像^[3]

多轮荧光成像读取RNA条形码信息后，经过条形码解码后，每个RNA分子不仅被准确识别其种类，同时还保留其在细胞内的精确空间坐标。结合细胞核和细胞膜的多通道荧光标记，通过图像分割算法可对组织切片进行细胞轮廓识别与分区，将每个RNA分子归属于特定单细胞。

图3. 使用MERFISH 同时检测单个细胞中140 种 RNA^[3]

图 (A) 显示了多轮杂交荧光成像；图 (B) 将检测到的所有 RNA 以二进制编码方式着色标出；图 (C) 和 (D) 展示了选定区域在各轮成像时的荧光信号及对应的二进制编码；图 (E) 比较了纠错前后基因拷贝数的变化。

MERFISH 技术优势

MERFISH在以下方面具有显著优势：

• 高通量与高分辨率：单次实验可同时检测数百至上千种RNA分子，并精确定位至亚细胞水平，实现空间维度上的解析。
• 高灵敏度与定量准确性：具备卓越的检测灵敏度，低丰度RNA亦可可靠识别。独特的组合编码与纠错机制大幅降低成像误差，保障数据准确性。
• 丰富的空间信息：不仅获取RNA表达量，更能精准记录其在细胞内的空间位置，揭示细胞内结构分区及细胞间的微环境差异。
• 广泛适用性：适用于新鲜、固定及FFPE样本，广泛应用于肿瘤、神经、免疫、发育与微生物生态等研究领域，展现出强大的平台通用性与科研价值。

MERFISH 的最新应用进展

MERFISH可以与CRISPR筛选联合使用，解析细胞内转录程序和微环境对基因表达的影响。Binan 等（2025）^[4]在《Cell》上发表的研究，通过该方法构建了细胞间及功能性转录调控网络，为基因功能研究和药物靶点发现提供新思路。

图4. 结合CRISPR筛选的空间转录组学示意图

《Science》发表的研究《Highly Multiplexed Spatial Transcriptomics in Bacteria》^[5]展示了MERFISH在细菌中的应用。Moffitt团队通过扩展显微镜优化MERFISH，实现了在单个细菌内同时检测数千个mRNA，并构建菌落的空间转录图谱，为肠道微生物和宿主—病原体相互作用研究提供了新工具。

图5. 细菌空间转录组学示意图

Fang 等（2022）^[6] 利用MERFISH对人类中及小鼠皮层进行高通量单细胞转录组成像，成功构建了一个高分辨率、空间定位的细胞图谱。通过对4000个基因进行成像，研究者不仅实现了对125个转录上显著不同的细胞群的识别，还揭示了各细胞群在皮层各层的分布模式和细胞间相互作用。这张图直观展示了MERFISH如何在不破坏细胞空间结构的情况下，获取高维转录组数据，并为后续细胞类型分类、层状分布以及细胞间相互作用分析奠定基础。

图6. 高通量空间成像

FluidicLab-基于成像技术的核心模块-多液路进样系统

FluidicLab提供的全自动多液路进样系统，集成控、流体交换和时序控制模块，支持多轮探针(如初级探针、信号放大探针)的自动化孵育与洗脱。微流控芯片-流动腔内置预载核酸/抗体探针池，并通过特定读写的自动化程序控制系统运转，提升单分子检测精度。

图7. 多液路进样系统组成

应用方向：

结合多重核酸探针的merFISH技术；

结合多重蛋白抗体的空间蛋白组学技术等。

参考文献:

1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S. & Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature596, 211–220 (2021).
2. Androvic, P. et al.Spatial Transcriptomics-correlated Electron Microscopy maps transcriptional and ultrastructural responses to brain injury. Nat. Commun.14, 4115 (2023).
3. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S. & Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science348, aaa6090 (2015).
4. Binan, L. et al.Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveals intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits. BioRxiv Prepr. Serv. Biol.2023.11.30.569494 (2023) doi:10.1101/2023.11.30.569494.
5. Sarfatis, A., Wang, Y., Twumasi-Ankrah, N. & Moffitt, J. R. Highly multiplexed spatial transcriptomics in bacteria. Science(2025) doi:10.1126/science.adr0932.
6. Fang, R. et al.Conservation and divergence of cortical cell organization in human and mouse revealed by MERFISH. Science377, 56–62 (2022).