实验方案：微流控混合方式制备PLGA纳米颗粒

2024-12-12
FluidicLab
PLGA纳米颗粒, 微流控, 纳米颗粒

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）因其独特的生物相容性、低免疫原性以及生物降解性，已被美国食品与药品管理局（FDA）批准用于药物辅料而进入药典。PLGA在人体内经过降解，生成乳酸与羟基乙酸，两者均是人体代谢的副产物，不具有毒性。

PLGA纳米颗粒的用途十分广泛。目前已有报道运用PLGA纳米颗粒包封一些治疗癌症的药物，如：阿霉素（DOX）、紫杉醇（PTX）、白藜芦醇等。与游离的药物相比，PLGA纳米颗粒包封的药物对肿瘤的治疗效果有所提升。此外，PLGA纳米颗粒还可以用于包裹蛋白质、多肽与DNA等生物大分子，以制备化妆品、骨修复材料等多类产品。同时，由于PLGA的机械强度大，其对包裹的内容物具有很好的保护作用。合适的制备工艺可以增加内容物的溶解性，提高其生物利用度，也可作为药剂缓释的载体。因此PLGA纳米颗粒具有广泛的开发前景。

温馨提示：由于实验方案在不断优化更新，以下实验方案内容仅供参考，如有需要，请通过网站上的联系方式向工作人员获取实时更新的版本PDF文件。（FluidicLab编辑并发布，转载请通知我们）。

实验目的及方法：

使用微流控方式，制备PLGA纳米颗粒

实验原理：

使用微流控进行PLGA纳米颗粒的合成，原理上分为两种。第一类称为“自上而下”的合成（Top-down，图1）。该类合成使用难溶于水的溶剂（如二氯甲烷，即DCM）溶解PLGA。当[PLGA-二氯甲烷]与[PVA-水]溶液接触时，两者混合发生乳化，形成较大的PLGA颗粒。初始产物的乳化液通过微混合器芯片的连续混合，分解成细乳化液。同时，有机溶剂扩散到周围的水相中（室温下二氯甲烷在水中的溶解度为2%），颗粒固化，直径进一步减小。

另一种称为“自下而上”的合成（Bottom-up，图2）。该类合成使用易溶于水的溶剂（如丙酮）溶解PLGA。在[PLGA-丙酮]与[PVA-水]溶液混合之时，PLGA自发、随机地析出形成微核。随着层流混合的加剧和丙酮浓度的持续下降，微核表面会持续析出PLGA，并逐步变大。该过程称为PLGA纳米颗粒的“生长”（Particle growth）。该过程会持续于整个微流控混合的过程中。而高效、均匀的混合可以确保该过程的持续性、稳定性和均一性，产生高单分散性的PLGA纳米颗粒。在该过程中以及合成完毕后，PLGA纳米颗粒会逐步硬化并形成最终产物。

实验材料：

试剂	脂质成分（溶于丙酮）	PLGA（LA:GA=50:50, 20 kDa）
	缓冲液成分（溶于超纯水）	聚乙烯醇（PVA，30000-70000）
	溶剂	丙酮
	溶剂	超纯水
耗材	合成需要	BD/新华/KDL 带鲁尔口的注射器若干
		Falcon 15 mL离心管（352096）
		20 mL棕色玻璃瓶若干
	若透析	生工透析膜，生物技术等级，CE膜，100 KD，扁平宽度24 mm，容积1.8 mL/cm （F131417-0001）
	若超滤浓缩	15 mL/100kD Milipore超滤管（外径50 mL）
	微混合芯片	FluidicLab 金属-玻璃芯片：MTGL-FL-001
设备	微流控PLGA合成	FluidicLab 智能纳米颗粒合成仪（NP-S2）
	PLGA检测	动态光散射仪（本文中使用Malvern ZS90）
	PLGA超滤	冷冻离心机
	PLGA冷冻干燥	冷冻干燥机

微流控法制备PLGA纳米颗粒的难点

溶解PLGA一般需要强有机溶剂进行，包括二氯甲烷、丙酮等。而这些强有机溶剂经测试，短时接触即会对常用芯片材质COC（或各类聚合物）造成不可逆损伤（图3. A）。内部混合结构会逐步被破坏，导致混合效果变差。若使用玻璃芯片，则存在价格高、需要专用注射器接头进行转接等问题。FluidicLab智能纳米颗粒合成仪（NP-S2），配合独创专利“金属-玻璃”芯片助力PLGA纳米颗粒的合成（图3. B）。

图3. A：丙酮对我司B1芯片（COC材质）的腐蚀测试。左侧鲁尔口注入丙酮，右侧未处理。芯片表面涂抹一定量的丙酮；B：丙酮处理后B1芯片内部鱼骨结构，箭头处可见裂纹；C：金属玻璃芯片实物图；图片由具有丙酮购买、使用资质的客户提供。

用于微纳颗粒合成的金属-玻璃芯片

该芯片与纳米颗粒合成仪NP-S2机型适配。适合于中等体积 (总合成体积0.4~40 mL)、中等流速 (总流速4～40 mL/min)下的各类纳米颗粒合成。

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实验步骤：

1.配置PLGA溶液

配置浓度为100 mg/mL的PLGA母液。

称取PLGA 1 g，加入10 mL丙酮。若溶解困难，可使用超声辅助溶解。使用0.22 μm的PTFE滤膜过滤，确保终产物中不含微小的固态颗粒。根据合成的PLGA粒径需要，可将PLGA稀释至不同的浓度。

使用微流控合成PLGA纳米颗粒时，PLGA纳米颗粒粒径与PLGA初始浓度相关联。当PLGA溶于丙酮溶液时，10 mg/mL PLGA可以获得该配方下粒径最小、最均一的PLGA纳米颗粒；其浓度对其合成后的粒径影响可分别参考附录-附件1。

2.配置PVA溶液

配置浓度为2%（w/v）的PVA溶液。

称取0.2 g PVA粉末，加入6 mL超纯水震荡，放入85℃水浴锅中搅拌、加热直至溶解。溶解后使用超纯水定容至10 mL。使用0.22 μm滤膜过滤，确保终产物中不含微小的固态颗粒。若需大量合成，则等比例放大配置量。

3.微流控合成（见智能纳米颗粒合成仪NP-S2操作说明）

在制备纳米颗粒(如LNP、Liposome)的过程中，关键步骤是有机相与缓冲液在微流控芯片中高速均匀的混合。通过先进的微流控技术，智能纳米颗粒合成仪(NP-S2)能够制备粒径高度均一且可控的纳米颗粒。经验证，S2同时具备了高重复性、低样本消耗、易于操作等优势，大幅提高了客户前期配方筛选的效率。

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当使用丙酮作为PLGA溶剂时，微流控合成中的实验参数推荐值如下：

总流速 12mL/min、流速比为1:1、以获得粒径最小且最均匀的PLGA。实验者也可以根据实验需求调节流速比、总流速等参数来获得更大粒径的PLGA纳米颗粒。本方案是PLGA空包的实验流程，根据文献报道及实验测试，一般包裹了药物后PLGA纳米颗粒的粒径会变大。变大程度与药物的种类、浓度相关。关于微流控参数对空包PLGA合成的影响见附录-附件2 ~ 3。

4.粒径和PDI的检测

由于合成的PLGA纳米颗粒中含有丙酮与PVA，过高的浓度会影响动态光散射仪（DLS）测量的准确性。我们根据测试（附录-附件4）推荐使用超纯水进行10倍稀释（产物 : 水 = 1 : 9），从而获得较为准确、可信而稳定的数据。DLS会测定粒径大小与多分散性指数（PDI），前者代表了纳米颗粒的大小，后者则反应了颗粒的均一程度。正常结果如图4所示：

5.PLGA后处理

A．透析

不同厂家的透析膜有不同的预清洗/预处理流程，请严格参考各厂家透析膜使用说明。本文以生工CE透析膜（F131417-0001）为例进行说明。

预处理时，在室温下，剪取所需长度的膜，将膜浸泡在蒸馏水中15~30分钟除去防腐剂，然后用去离子水彻底冲洗膜。该款膜为防腐剂湿型包装，建议佩戴口罩、手套等防护用品操作。不推荐煮沸处理，以免损坏膜管或膜孔径。

注意：膜一旦处理为潮湿状态，不可让膜变回干燥状态，以免造成孔隙结构损坏。

由于我们使用的PVA分子量在30 K-70 K之间，故不建议使用100 kD以下孔径的透析袋或膜，过小孔径的膜会导致PVA被截留在袋内。

用透析膜夹，密封夹住透析膜一端；将合成后的PLGA纳米颗粒初产物液体直接移入透析袋，尽可能排空气泡。随后用透析膜夹封住另一端。为确保密封，可将冗余部分透析袋翻折后再夹紧。将该装有PLGA纳米颗粒初产物的透析袋置于至少100倍体积的超纯水中，室温透析至少6h，或透析过夜。在透析2h后，中途进行1~2次换液。

B．超滤

若不进行透析，初产物PLGA也可使用超纯水补足到15 mL，加入100kD超滤管中。于4 ℃，4000 g；离心45分钟。如此反复进行三次超滤。

对于PLGA纳米颗粒，我们更推荐超滤的方式进行后处理。此步骤有别于LNP合成。

超滤或透析后，每1mg PLGA产物加入1mg海藻糖/蔗糖进行保存，短期可保存于4℃，长期保存则需进行冷冻干燥。

6.PLGA的冷冻干燥

冷冻干燥后，PLGA可以重新溶解于水相。根据我们的实验结果可知，无保护剂情况下重新溶解的PLGA纳米颗粒粒径与PDI都与原始颗粒相比，显著增大；而加入蔗糖或海藻糖作为保护剂后，能够有效稳定PLGA纳米颗粒。冷冻干燥步骤如下：