益生菌的研究
益生菌是可以寄宿于人体内产生有益影响的一类微生物的总称[1]。常见的益生菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等[2]。这些益生菌不仅可以促进肠道消化、改善肠道环境。新的研究更是发现许多益生菌对心血管疾病、白血病、癌症等疾病的治疗和改善有着积极的作用。基于上述功效益生菌已经被广泛应用到食品、保健品以及医药行业中，具有一定的商业价值。主要产品形式如乳制品、粉剂以及膳食等都已在市场上广泛销售。
世界卫生组织对益生菌的定义是当摄入足够量时能够对宿主健康有利。因此保持体内的益生菌活性和数量对其发挥功能至关重要。然而，人体内不同微环境下的pH值差异较大。人体中分泌的体液也会对微生物的活性造成影响。这对大多数微生物而言都是不易生长的环境。因此如何让益生菌不受影响地到达目标部位是一个亟待解决的难题。
图1.人体内环境pH值
益生菌的递送方法
常规的益生菌递送形式分为活益生菌、失活益生菌、益生菌孢子以及益生菌+益生元复合模式等。活益生菌递送是指服用活的益生菌并在消化道的作用下到达靶点区域，在该区域进行繁殖生长。这种方式递送的菌活性较高但在实际应用中受限于益生菌的种类。失活益生菌递送则是指将灭活后的益生菌送入目标区域，这种情况下主要依靠其代谢产物发挥作用。而益生菌孢子递送利用了孢子的强抗逆性来抵御人体内的不利环境并在靶标区域萌发为活性菌从而发挥作用。益生元是一类可以被肠道微生物降解的营养素[3]。在益生菌菌剂中添加益生元有利于益生菌的促进和生长。
递送益生菌的水凝胶微球的研究
益生菌微球是一类新兴的递送技术手段。这一技术通过将益生菌或复合菌包裹在密闭的材料中实现对内部有效物质的保护并提供一定的靶向性[4]。这项技术中外壳材料的选用是确保微球稳定性的关键。理想的益生菌微球外壳还需要可以保护益生菌抵抗氧应激、渗透压胁迫和胃酸环境等不利因素[5]。海藻酸钠（Sodium alginate）、壳聚糖（Chitosan）、透明质酸(Hyaluronic acid)以及乳清蛋白(Whey Protein)等材料已经在实验中被证明有良好的抗性。这些材料都具有生物相容性好、无毒性和可降解性等特点[6]。
图2.理想的益生菌微球释放过程
Kim J, Muhammad N, Jhun B.H. et al. Probiotic delivery systems: a brief overview. Journal of Pharmaceutical Investigation .2016
海藻酸钠是一种从褐藻或马尾藻中提取出的产物。它是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性，在食品工业和医药领域有着广泛的应用。海藻酸钠已经被证实可以用来培养细胞、递送药物等。当海藻酸钠微球进入胃液中时会受到低pH值的影响进一步收缩从而避免内含物的释放[7]。而在肠道环境下，海藻酸钠表面的羧根之间的静电斥力使得水凝胶表面变得松散。另一方面羧根又可以与水形成氢键增加了微球的疏水性。这都使得被包裹的内含物更容易释放出来。Li等人利用海藻酸钠与纤维素混合包裹植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）成功实现了该菌在肠道的定向释放[8]。
图3.海藻酸钠与纤维素混合包裹益生菌微球的研究方案
Li W, Luo X, Song R, et al. Porous Cellulose Microgel Particle: A Fascinating Host for the Encapsulation,Protection, and Delivery of Lactobacillus plantarum. Agric Food Chem. 2016;64(17):3430-6.
透明质酸是细胞外基质的主要成分之一，广泛存在于结缔组织、上皮组织以及神经组织中。该物质可以与免疫细胞膜上的CD44相互作用调剂巨噬细胞分化发挥抗炎作用[9]，是一类理想的医学生物材料，在医疗美容领域都有着重要的作用。透明质酸微球常被用于药物递送、细胞递送和软组织填充等方面。甲基丙烯化透明质酸包裹的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）形成的水凝胶微球可以加速感染伤口的愈合[10]。除了单一结构的微球包裹方案外，多成分组成的核壳结构也是目前一个大的研究热点，比如海藻酸按——壳聚糖结构[11]、海藻酸钠——纤维素结构[12]。在此之上形成的三层结构也可以进一步提高微生物的包封率[13]。
图4.核壳结构微球包裹
Shishuai Q, Weinan C, Xiaoguang Z, et al,Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery,International Journal of Biological Macromolecules,2024.
核壳结构一方面可以增强外壳的结构稳定性，另一方面还可以使那些无法单独包裹的材料运用到益生菌递送中。与单壳结构相比，核壳结构的释放更加缓慢，更适用于肠道远端菌群的释放。但也有研究认为多层的核壳结构不一定可以有效益生菌存活率，多种成分甚至可能会对益生菌产生毒害作用[14]。
图5.不同结构的微球释放速率
Shishuai Q, Weinan C, Xiaoguang Z, et al,Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery,International Journal of Biological Macromolecules,2024.
FluidicLab包裹益生菌水凝胶微球解决方案：
微流控技术利用微流道处理液滴，通过分散相和流动相之间的剪切生成微液滴。该方法相较于传统的化学合成法可以实现在微米级别生成粒径均一且稳定的微球，适用于海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸以及聚丙烯酰胺等多种材料。
图6.微流控技术形成的微球
FluidicLab微流控设备
FluidicLab团队拥有丰富的微球制备经验。本公司利用自主研发的微滴生成仪配套压力控制器以及流量传感器可以实时监测芯片流道中的液体，从而实现可控的目的粒径的微滴生成。芯片的尺寸、结构以及材质等参数对微球的生成也有重要的的影响。
图7.FluidicLab微流控设备
离子交换法生成的海藻酸钠微球的pH偏中性，有利于细胞、微生物等内含物的生长。FluidicLab利用该方法包裹的益生菌固化后平均粒径280um且CV值小于5%。这一结果表明生成的微球大小均一可控，满足后续的实验要求。
图8.微流控技术生成的海藻酸钠益生菌微球
参考文献
[1] Sanders ME, Merenstein DJ, Reid G, et al. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019;16(10):605-616.
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[5] Kim J, Muhammad N, Jhun B.H. et al. Probiotic delivery systems: a brief overview. Journal of Pharmaceutical Investigation .2016,46,377–386.
[6] Shishuai Q, Weinan C, Xiaoguang Z, et al,Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery,International Journal of Biological Macromolecules,2024, 254(2),127649.
[7]Chen SC, Wu YC, Mi FL, et al. A novel pH-sensitive hydrogel composed of N,O-carboxymethyl chitosan and alginate cross-linked by genipin for protein drug delivery. Control Release. 2004;96(2):285-300.
[8] Li W, Luo X, Song R, et al. Porous Cellulose Microgel Particle: A Fascinating Host for the Encapsulation, Protection, and Delivery of Lactobacillus plantarum. Agric Food Chem. 2016;64(17):3430-6.
[9] Litwiniuk M, Krejner A, Speyrer MS, et al. Hyaluronic Acid in Inflammation and Tissue Regeneration. Wounds. 2016;28(3):78-88.
[10] Ming Z, Han L, Bao M, et al. Living Bacterial Hydrogels for Accelerated Infected Wound Healing. Adv Sci. 2021;8(24):e2102545.
[11]Wu QX, Xu X, Xie Q, et al. Evaluation of chitosan hydrochloride-alginate as enteric micro-probiotic-carrier with dual protective barriers. Int J Biol Macromol. 2016;93(Pt A):665-671.
[12] Li W, Luo X, Song R, et al. Porous Cellulose Microgel Particle: A Fascinating Host for the Encapsulation, Protection, and Delivery of Lactobacillus plantarum. J Agric Food Chem. 2016 4;64(17):3430-6.
[13] Mariana de A E, Graciele L N, Bruna R N et al, Improvement of the viability of encapsulated probiotics using whey proteins.LWT. 2020; 117: 108601.
[14] Yeung TW, Üçok EF, Tiani KA, et al. Microencapsulation in Alginate and Chitosan Microgels to Enhance Viability of Bifidobacterium longum for Oral Delivery. Front Microbiol. 2016;7:494.
公安备案号31011002005499