FluidicLab客户文献导读
成果简介：中国医药工业研究院国家先进医学工程研究中心的何军团队在《Nano Today》上发表了题为“Designed microchannel-based lipid nanoparticles encapsulated siRNA targeting gasdermin D for sepsis management via pulmonary delivery”的文章。GSDMD（Gasdermin D）属于Gasdermin蛋白家族，对其表达的抑制可以有效降低细胞膜穿孔从而抑制细胞焦亡。研究团队设计了一种新型连续微流控平台（CA/SAR/C1），通过优化微通道结构和流体动力学特性，高效制备封装siGSDMD（靶向Gasdermin D的小干扰RNA）的脂质纳米颗粒（LNPs）。siGSDMD-LNPs 在体外和体内研究中均表现出优异的递送和沉默功效，证明其通过抑制细胞焦亡，显著缓解脓毒症相关的炎症反应和器官损伤。
图1. CA/SAR微通道和CA/SAR/C1生产质量稳定的LNP的扩展策略
混合微流道设计、模拟。得到最优候选流道（Type C）
基于环形非对称分裂重组（Circular Asymmetric Split-and-Recombination, CA/SAR）原理，作者设计了三种候选微通道（Type A、B、C），其主次宽度比分别为1:1、2:1、3:1（图2）使用软件模拟流体行为，通过一系列的方程计算，并通过计算混合指数（MI）、压力降（ΔP）和混合效率成本（Mec）等关键参数，筛选出Type C为性能最优结构（图3）。通过CFD模拟评估混合效率，发现Type C（3:1）在雷诺数（Re）≥100时仅需3个循环即可实现90%以上的混合效率（Mixing Index, MI）（图4），为三者最优。
图 2.候选圆形 SAR 微通道图示及三个候选微通道在不同雷诺数 （Re） 下的单独混合行为
图 3. CFD模拟不同网格下的浓度和速度分布以及三种微通道的MI、△Pa 和 Mec
图4. Type A, B, C在截面0, 2, 4, 6（对应不同循环次数）和不同Re下的混合性能比较。
LNP制备实验中，Type C具有较好的混合效果
作者通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和动态光散射（DLS），验证Type C在LNPs制备时能实现均匀的混合，其制备的LNPs粒径较小（50nm以下）且分布均匀（多分散指数PDI<0.1）。形态观察到为致密的球形颗粒（图5）。该芯片LNP合成效果佳。该混合芯片由我司，上海澎赞生物有限公司制作。
图 5.C 型 （Re=660） 数值和实验之间的流体行为验证
制备得到的siGSDMD-LNPs具有优异的物理化学性质、稳定性和长期储存性能
作者通过WB筛选了有效的siRNA序列，并对于制备的siGSDMD-LNPs进行表征。在PBS (pH 7.4)、FBS或小鼠血浆中稀释时，siGSDMD-LNPs均表现出比游离siGSDMD显著更高的稳定性，表明LNPs有效地保护siGSDMD在FBS或血浆存在下不降解，具有相比游离siGSDMD更高的稳定性（图6）
图6. siGSDMD-LNPs的物理化学性质表征
siGSDMD-LNPs可被BMDMs摄取，并且siRNA可溶酶体逃逸
为了探究骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）是否能摄取siGSDMD-LNPs，作者通过流式细胞术和CLSM检测了细胞活力以及siRNA的溶酶体逃逸能力。流式细胞检测显示 ，LNP （FAM 标记的 siGSDMD、DID 标记的脂质） 成功被 BMDM 内化 （图 7A-D）。siGSDMD-LNPs 对细胞活力没有显着影响（图 7E）。在 4 小时和 6 小时时，FAM 标记的 siGSDMD 逐渐分散在整个细胞质中（图 7G），表明其能够进行溶酶体逃逸，该LNP可以负载 siRNA 进行胞内递送。
图7. LNPs在细胞内摄取和递送效率的评估
siGSDMD-LNPs在体外具有抗炎作用
作者检测了siGSDMD-LNPs在体外对BMDMs中GSDMD表达和炎症因子释放的抑制作用。在mRNA水平，siGSDMD-LNPs显著下调LPS诱导脓毒症小鼠的GSDMD的表达。BMDMs中GSDMD的表达降低，显著降低了细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-⍺的水平(图8I-K) 。该结果证明siGSDMD-LNPs通过抑制GSDMD介导的细胞焦亡，在脓毒性条件下对巨噬细胞发挥抗炎作用。
图8. LNPs在体外抗炎效果的评估
siGSDMD-LNPs肺部给药，在小鼠体内主要分布于肺部，且肺部积累，稳定时间长
肺部给药后，通过活体成像系统及离体器官检测了siGSDMD-LNPs在小鼠体内的组织分布，发现LNPs在肺部蓄积显著高于游离siRNA，表明肺内给药的有效性（图9）。
图9. LNPs在小鼠体内的组织分布
肺内给予siGSDMD-LNPs显著降低了脓毒症小鼠肺组织中GSDMD的表达量和炎症因子的表达，减轻了肺组织损伤，提高了生存率
LPS诱导的败血症小鼠经肺部给药siGSDMD-LNPs后，肺中GSDMD蛋白和炎症因子表达显著降低（图10）。siGSDMD-LNPs也显著减轻了脓毒症小鼠肾脏和肝脏组织的损伤，降低了GSDMD和炎症因子的表达，且在多器官保护方面具有有效性（图11）。siGSDMD-LNPs对LPS诱导的脓毒症小鼠模型有显著的治疗效果。
图10. LNPs在体内治疗效果评估
图11. LNPs在多器官保护方面的评估
讨论与总结
综上所述，作者设计了一种基于微流控技术的连续制备平台，其核心优势在于非对称微通道设计和梯度稀释系统的结合，并用于制备高质量的siGSDMD-LNPs。 siGSDMD-LNPs具有良好的细胞摄取、溶酶体逃逸能力和组织分布特性，并通过沉默GSDMD有效抑制细胞焦亡，为脓毒症的治疗提供了新策略。
公安备案号31011002005499